細(xì)胞支原體污染的熒光檢測方法

DNA螢光染色法

· 原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 

· 特點(diǎn)︰簡單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟?？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。 
· 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有螢光背景，影響判讀。 


步驟： 
· 取出培養(yǎng)之Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液,用PBS洗滌三次。 
· 于每個(gè)well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置5-10 min。 
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的封片劑，并以蓋玻片覆蓋之。 
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之螢光物產(chǎn)生。 
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其螢光可維持?jǐn)?shù)星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測試樣品有支原體的污染。 
(A)Negative result 
螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測試樣品沒有支原體的污染。 

(Positive Result 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測試樣品有支原體的污染。